呕吐毒素，是常见的污染之一，人一旦积累严重甚至造成死亡

阅读文章前，辛苦您点下右上角的“关注”，方便您讨论分享，持续关注每日优质内容~

呕吐毒素，又名脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)，是一种由镰刀菌属产生的有毒的次级代谢产物。

在谷物及其加工副产品中经常检测到DON污染。

DON能够在食物链中积累，当家畜摄入了被DON污染的食物后会产生厌食、呕吐、腹泻、发烧等急性中毒症状，严重时损害造血系统造成死亡。

DON被国际癌症研究机构归类为第3类致癌物质，可引起急性毒性、胃肠道毒性、肝毒性、免疫毒性、发育毒性、生殖毒性、神经毒性、核糖体毒性等。

近几年，DON污染非常严重，DON污染防控是世界性难题，在非洲、亚洲、美洲、欧洲和中东等均很普遍。

2004年至2011年对全球17 316个样本的调查显示，与玉米赤霉烯酮(ZEN)、黄曲霉毒素(AFT)、伏马菌素(FB)和赭曲霉毒素A(OTA)相比，DON是最主要的毒素污染，污染率为55%。

2018年进行的另一项调查，其中包括来自全球77个国家的13 629个样本，表明DON是分布广泛的毒素之一。

DON因其污染普遍和对人畜健康的危害，迫切需要开发有效降解DON的方法。

目前针对DON污染防控已有许多报道，包括DON的田间管理和培育抗病作物等，以及使用物理、化学和生物方法对毒素进行脱毒。

物理和化学方法包括臭氧处理、紫外照射、过热蒸汽和碱处理等。

然而，由于DON的结构性质稳定，传统的物理方法的效率很低;化学方法虽然可以达到很好的解毒效果，但与其他有毒化学物质混合破坏了饲料的营养品质和价值。

另外，物理和化学方法设施设备条件要求高。

生物降解因其具有高效、反应条件温和、可持续性和环境友好等优点，具有开发应用前景，受到越来越多研究人员的关注。

目前，在国内外已经有大量有关微生物降解DON的报道。

Zhang等从海水中筛选到1株耐盐海杆菌(Pelagibacterium halotolerans)ANSP101，在12 h内将DON(50 μg/mL)降解了76.85%，其发挥作用的是细胞裂解液中的胞内酶。

Shima等从土壤中富集到了1株根瘤农杆菌(Agrobacterium rhizobium)E3-39，可以在24 h内完全降解DON(200 μg/mL)。

Jia等从驴肠道中分离到1株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ASAG 216，能在8 h内对100 μg/mL DON降解81.1%，其活性物质来自培养上清液中的胞外酶。

本研究从霉菌毒素污染严重的田地和养殖场中采集了土壤和动物(鸡、猪)粪便等样品，以DON为唯一碳源，筛选能够降解DON的微生物，初步研究土壤及猪、鸡粪便中是否存在能有效降DON的微生物、该菌株解毒活性物质的分布、DON降解产物对猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)的毒性作用，从而为食品和饲料中DON污染防控提供一种选择。

样品采自黄淮海区域小麦田和玉米田土壤以及鸡、猪养殖场粪便。

材料:DON购自青岛某生物工程有限公司，溶于乙腈(纯度99.9%)，终浓度为10 μg/mL。

营养肉汤培养基(NB)、营养琼脂培养基(NA)、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、青霉素-链霉素、磷酸盐缓冲液(PBS)、胰蛋白酶和二甲基亚砜(DMSO)、蛋白酶K(PK)、十二烷基硫酸钠(SDS)均购自北京索莱宝科技有限公司;细菌基因组DNA纯化试剂盒购自北京天根生化科技有限公司;Annexin V-EGFP/PI Apoptosis Detection Kit购自江苏凯基生物技术股份有限公司;Cell Counting Kit-8购自大连美仑生物技术有限公司;IPEC-J2细胞由河南农业大学动物医学院杨旭博士赠予。

培养基配制:富集培养基，0.25 g NaNO3，0.25 g KCl，1 g K2HPO4，0.1 g Fe2(SO4)3·7H2O，0.5 g MgCl2，0.1 g酵母膏，0.1 g玉米浆，调pH至7.0，用蒸馏水定容至1 L，121 ℃灭菌30 min。

初筛培养基，0.5 g (NH4)2SO4，0.2 g MgSO4·7H2O，0.05 g CaCl2，2.44 g NaH2PO4，1.52 g KH2PO4，琼脂15 g，调pH至7.0～7.2，用蒸馏水定容至1 L，121 ℃灭菌30 min，以DON(1 μg/mL)为唯一碳源。

IPEC-J2细胞在含有4.5 g/L葡萄糖、10%胎牛血清、青霉素(100 IU/mL)和链霉素(100 mg/mL)的DMEM培养基中，在37 ℃、5%二氧化碳(CO2)的培养箱中培养。

从粪便和土壤中共采集了60份样品，每份样品取1 g溶于10 mL生理盐水中，室温下160 r/min振荡1 h，静置10 min。

吸取1 mL上清至2 mL离心管中，4 000 r/min离心2 min。

吸取1 mL上清液添加至富集培养基中培养24 h。

将富集后的菌液梯度稀释，涂布于初筛培养基上培养72～96 h。

挑选初筛培养基中长势优良的菌落，接种于富集培养基中，37 ℃培养24 h;培养结束后吸取100 μL菌液涂布至初筛培养基中继续培养72～96 h，重复3次。

将长势良好的单菌落进行纯化培养，用50%的甘油保存，置于-80 ℃冰箱中保存备用。

将上述试验筛选得到的菌株活化扩增，然后与DON(终浓度1 μg/mL)共同孵育96 h，待结束后加入等体积的甲醇并涡旋10 s来终止反应。

在4 ℃、12 000 r/min离心3 min，上清液先通过0.22 μm滤器过滤，再通过DON免疫亲和柱纯化，然后应用高效液相色谱仪(Agilent-1290)进行分析[24，27]。

液相色谱条件:色谱柱为Eclipse Plus C18(2.1 μm×100 mm，1.8 μm)，进样量为2 μL，流动相为乙腈-水(10∶90)，流速为0.1 mL/min，柱温为30 ℃，检测波长为218 nm。

参照《伯杰氏细菌鉴定手册(第8版)》的研究方法，对菌株进行形态学和生理生化鉴定。

应用16S rRNA和特异性序列gyrB测序对分离筛选到的菌株进行鉴定。

提取菌株基因组DNA，设计16S rRNA序列和gyrB基因的引物，PCR扩增产物送尚亚生物技术有限公司进行测序。

应用MEGA11.0版软件包，采用邻接法构建系统发育树，构建1 000个Bootstrap重复序列。

引物名称 Primer name

引物功能 Primer function

序列 Sequence

27F

16S rRNA测序

5′-AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3′

1492R

16S rRNA测序

5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′

UP-1

gyrB扩增

5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA(TC)GC(TCAG)GG(TCAG) GG(TCAG)AA(AG)TT(TC)GA-3′

UP-2r

gyrB扩增

5′-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCC(AG)TC(TCAG)AC(AG) TC(TCAG)GC(AG)TC(TCAG)GTCAT-3′

UP-1S

gyrB测序

5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA-3′

UP-2sr

gyrB测序

5′-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCC-3′

参考Rao等的方法，测定筛选细菌培养液、细胞悬浮液、培养上清液和细胞裂解液等组分对DON的降解能力。

将筛选菌接种于NB培养基中，37 ℃培养24 h制得培养液。

细胞悬浮液制备:细菌培养液离心后去除上清液，细菌沉淀经PBS洗涤3次并重新悬浮。

培养上清液制备:细菌培养液离心得到上清液，0.22 μm滤器过滤。

细胞裂解液制备:细胞沉淀经PBS悬浮，使用细胞超声波仪粉碎(400 W，工作5 s，间歇5 s)，在4 ℃、6 000 r/min条件下离心10 min，取上清液，应用0.22 μm滤器过滤。

将100 μL DON(终浓度1 μg/mL)分别加入900 μL细菌培养液、细胞悬浮液、培养上清液和细胞裂解液中，在37 ℃培养48 h。

以NB培养基和PBS作为空白对照，应用UPLC检测DON的残留量，从而确定活性物质的分布。

为了进一步研究活性物质的性质，应用加热、SDS和PK对主要活性组分进行处理，检测DON的降解率。

各组处理方案如下:加热处理，100 ℃处理培养上清液30 min;SDS处理，加入1% SDS，37 ℃作用6 h;PK处理，加入10 mg/mL的PK，37 ℃水浴1 h;SDS+PK处理，加入10 mg/mL的PK，10% SDS，37 ℃作用6 h。

将不同处理分别与DON(10 μg/mL)在37 ℃，180 r/min孵育72 h。

应用UPLC检测DON的残留量。

DON溶液的配制。

将H7菌株培养液，在4 ℃、10 000 r/min的条件下离心，然后0.22 μm滤膜过滤，收集上清液。

将DON溶于上清液中，分别用含有10% FBS和1%青-链霉素的完全培养基配成浓度分别为0.5和1.0 μg/mL的DON溶液，0.22 μm滤膜过滤。

DON降解产物溶液配制，将H7菌株培养液与DON(1.0 μg/mL)在37 ℃孵育，使DON的浓度达到0.5 μg/mL(UPLC测定)。

在4 ℃、10 000 r/min条件下离心，0.22 μm滤膜过滤，收集到的上清液立即放入4 ℃冰箱保存。

降解产物经过DON免疫亲和柱，去除DON，收集剩余液体。

收集到的液体经过冷冻离心浓缩仪，浓缩之后，再分别用含有10% FBS和1%青-链霉素的完全培养基配成浓度分别为0.5和1.0 μg/mL的降解产物溶液。

NC组:不含DON的上清液配成的细胞完全培养基。

操作全程在4 ℃无菌条件下进行。